陸光祖，字與繩，平湖人。
祖父陸淞，父親陸杲，都是進士。
陸淞任光祿卿。
陸杲任刑部主事。
陸光祖十七歲時，與父親同時在鄉試中舉。
不久考中嘉靖二十六年(1547)的進士，授職為睿縣知縣。
兵部尚書趙錦發布命令讓京郊的百姓修築邊牆，陸光祖稱不利。
趙錦惱怒，彈劾他。
陸光祖向巡撫陳述，請求發放雇工費，百姓才安定。
郡王搶奪民産，陸光祖依法加以制裁。
他調任南京禮部主事，因急事請假回鄉。
回任後補祠祭主事，曆任儀制朗中。
嚴讷任尚書，向來器重陸光祖，他的提議沒有不批準的。
等到嚴讷改任吏部職，調陸光祖擔任驗封郎中，又改任考功郎中。
王崇古、張瀚、方逢時、王一鹗為輿論困擾，陸光祖極力替他們洗刷。
不久他改任文選郎中，更加盡職發掘人才，對那些素有威望的士大夫盡數選用。
又破格提拔廉潔、能幹的官吏王化、江東、邵元善、張澤、李珙、郭文通、蔡琮、陳永、謝侃。
他們或者是由鄉裡舉薦的貢士，或者是由書吏中提拔。
因此下層官吏競相勉勵，嚴讷也全力任用他，所以陸光祖能夠實現意願。
左侍郎朱衡懷恨陸光祖，在背後議論，禦史孫丕揚就以專權之罪彈劾陸光祖。
當時他已調任太常少卿，被撤職閑居。
大學士高拱掌管吏部，謀劃傾覆徐階。
徐階的賓客都躲避了，唯獨陸光祖替他申辯。
等到高拱罷職，楊博代替他負責吏部，認為他仗義，特意啟用陸光祖為南京太仆少卿。
還沒上任，就升任本寺卿。
不久又升任大理寺卿。
半路上聞報父親去世，回家奔喪。
萬曆五年(1577)出任原職。
張居正因為居喪未滿奪情出任官職，杖責議論的人，陸光祖送信規勸他。
等到王用汲彈劾張居正，張居正即将重懲他時，當時任大理寺卿的陸光祖極力解救使他幸免。
張居正與陸光祖同年考取進士，相互友好，想引薦他做助手，陸光祖不屈身相随。
等到他調任工部右侍郎，因為議論漕運改為折色銀兩而違逆了張居正，禦史張一鲲疏論他，陸光祖就稱病回鄉了。
萬曆十一年(1583)冬天，他被舉薦擔任南京兵部右侍郎。
才過十來天，就召任他為吏部職。
他把張居正所摒棄的老成人全部召回安排在九卿各部中，安置了很多人。
李植、江東之極力請求治張居正的罪，陸光祖稱張居正輔佐的功績不可抹